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唾液酸分析问题集锦---UHPLC 分析柱使用和保存

1,Ludger试剂盒(LT-KDMB-A1)可以分析细胞糖基化吗?

答:这取决于糖基化类型。 我们试剂盒可以从糖蛋白释放多糖,我们也有试剂盒作用于糖脂释放多糖。

2, 唾液酸释放步骤,如果我们是IgG 唾液酸含量较少,说明书提高可增加到200ug?

答:样品量可以是50µg ,对于唾液酸含量低的可以提高到200µg。 而且也可以提高到500µg(如果NEU5AC含量特别低,为了保证NEU5AC content between 10 pmol up to 2.5 nmol)。

答:如果客户的唾液酸含量比较低的话,是可以提高样品量的,我们IgG-type 样品曾经用过50µg to 1 mg 的量。对于该特定样品,最佳起始样品用量为200-600µg (验证研究中样品用量范围的线性比例)。而且其他试剂的量不需要改变,但是就像说明书中所说的,如果唾液酸量低可以在LC上跑样品时不需要稀释了。

3,样品在酸解前进行悬干后,标记前后是否需要再次悬干?

答:只有在试剂盒使用前的样品准备阶段干燥---也就是酸解释放前的阶段,只有此阶段需要旋干,其他步骤不需要。

4, 样品分析前是否需要做特殊的处理,比如纯化等?保留的试剂如标记试剂,还原剂等会影响图谱结果吗?


答:在释放和标记阶段就进行过了优化,所以在上样分析前不需要进行纯化和其他处理

5,样品旋干的目的是什么呢?也就是说明书第二步samples dry in vacuum centrifuge目的?主要是为了去除一些盐和缓冲液杂质,更方便后面的标记和分析吗?
答: Sample is dried to prevent dilution of the acetic acid that you are going to add in the next step. And for quantitative purposes, drying helps to make sure that all samples and standards have the same final volume.

6,标记的DMB复溶之后,如果一次用不完,如何保存,可以保存多久;
答:一旦打开后立即使用,具有光敏性,放久了会变褐色。


7,样品取出步骤,样品旋干后可以第二天进行下一步吗?如果可以,存-18度是否可以?
答:不能马上分析的样品需要在-18°C黑暗保存。应当在24小时内完成整个分析。

8,试剂盒中两个标品 CM-NEUAC-01 ,CM-NEUGC-01 ,没有标明分子量,请问分子量是多少?如何处理标品?
答:MW of NeuAc is 309.27g/mol and NeuGC is 325.27g/mol,如何处理请参考Guide里第8步

9,糖肽标准品和胎球糖蛋白 这两个阳性对照都要用吗
答: Yes. 但也不是必须的,可以使用其中一个,建议2个都用。 GPEP是作为跟样品一样使用的,需要一次性溶解,可以把10ug粉末直接加入到释放和标记的流程。https://www.ludger.com/presentation/glycopeptide-quantitation-gpep-a2g2s2/

就如KDMB说明书所说的,1)把样品溶解在2M acetic acid里释放 2)释放完成后加5ul到一个管子用DMB标记 3)加入标记试剂然后孵育。 这个步骤可以不需要用水溶解。

10, HPLC分析的进样量是多少?
答: In the sialic acid analysis we typically run the NeuAc standard in a range between 100fmol to 10pmol on our HPLC system. This should be an indication, but it will be dependent on the sensitivity of the customers system。We also injecting is 40pmols of DMB labelled sialic acid (response is ~2000mV) in one injection and this is within the linear range of our detector.

11, 进色谱上样前用水上就行,还是需要分离相?
答: 色谱上样前用平衡液, 为了保证柱子的使用条件较好,在每个样品最后,我们推荐用50%DMB标记的唾液酸分离溶剂和50%的乙腈.柱子需要在50%的乙腈里面。

如果柱压不合适,存储在了纯乙腈中,因为柱子储存在纯乙腈中(没有水),我们建议重新平衡柱子,以慢流速连续数小时,并缓慢增加水的百分比。开始以95%乙腈 ACN/H2O几个小时,然后慢慢加水到50%乙腈,然后再引入唾液酸分析起始梯度(乙腈:甲醇:水9:7:84) 慢流速几个小时。

12,可能导致重复性一致的影响因素有以下几个:

1) 移液器的刻度校准不好(用移液器吸液体时的误差)。2) 操作人员需要很好的培训和经验—唾液酸的释放和标记需要操作员很精确和严格的—因为操作体积比较小,操作时需要注意。 3)明确的标品操作-- 4) 标记后的样品要直接分析,不要存放,否则很容易受光的影响。

13,硫酸或醋酸或唾液酸酶能不能将抗体分子上唾液酸完全解离或切除下来?假如可以,用什么方法可以证明它们能将抗体分子上唾液酸完全解离或切除下来?

答:作为阳性对照,我们建议使用包含NeuAc和NeuGc唾液酸的胎球糖蛋白,我们同样建议使用最纯化的LudgerBioQuantTM糖肽标准品来作为阳性对照。这个糖肽标准品(货号: BQ-GPEP-A2G2S2-10U)是一个复杂的N-连接双触角聚糖,终止于两个N-乙酰神经氨酸。使用此标准品可以检查聚糖释放、标记和回收的有效性,并可增强您的唾液酸测量准确性。

14,如果β巯基乙醇是用来溶解低亚硫酸钠的话,为什么不直接用水溶解?是否还有别的作用?
答:巯基乙醇可以让标记后的产品更稳定。

唾液酸分析产品选择http://www.ludgersh.com/shownews.asp?catID=21&nID=280

唾液酸试剂盒(LT-KDMB-A1)使用说明书:http://www.ludgersh.com/9ysh/up/updown/201812435793881.pdf

唾液酸UPLC(LS-UR2-2.1x100)分析柱使用说明书:http://www.ludgersh.com/9ysh/up/updown/201953055878097.pdf 

 

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